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耳针作用的形态学基础―来自HRP神经示踪法的证据

2019-12-08 18:45:55

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                   作者:梅志刚,朱兵,何伟 ,高昕妍

【摘要】   目的观察支配耳甲区迷走神经在延髓水平中枢的投射情况,探讨耳针作用机理。方法健康成年SD大鼠10只,外耳道口方向分离耳甲皮肤与皮下组织,微量注射器缝内注射40 μl 浓度为30%的HRP神经示踪剂,神经示踪技术观察标记细胞在延脑水平核团分布情况。结果除了在三叉神经脊束核外,在孤束核和迷走神经运动背核以及其他核团也发现了标记神经元或神经纤维。结论耳甲区迷走神经分支与迷走初级中枢有神经联系,耳甲穴位针刺效应很可能是通过耳-迷走反射途径实现的。

【关键词】   耳针; 孤束核; 迷走神经运动背核; 辣根过氧化物酶

  Abstract:ObjectiveTo observe projections of nervus auricularis vagi in brain stem of oblongata level,and to study the mechanism of auricular acupuncture. MethodsTen SD rats were used in this experiment, a skin incision was performed in the region of auricular concha of each rat, forty microliters of a 30% solution of horseradish peroxidase (HRP) in normal saline were subcutaneously injected into the cut central end of auricular branch of vagus nerve, then distribution of the labeled neurons in the primary brain stem was observed using HRP retrograde tracing technique. ResultsLabeled neurons and fibers were seen in the nucleus of solitary tract, dorsal nucleus of vagus nerve and other nucleus besides nucleus of spinal tract of trigeminal. ConclusionThere exists neural projection to NTS and DMV from the terminal of auricular vagus branch, maybe effect of auricular acupuncture is completed through auricular-vagal reflexes.

  Key words:Auricular acupuncture;   Nucleus of solitary tract;   Dorsal nucleus of vagus nerve;   Horseradish peroxidase (HRP)
   
  “耳为宗脉之所聚”,耳穴特别是耳甲区穴位刺激作为针灸诊疗学的一个分支的应用受到古今中外临床医生的青睐,其适应证多为高血压病、糖尿病、癫痫、失眠等病[1]。自从1957年法国外 科学 博士Nogier发现耳穴的坐骨神经点与第4腰椎骨有解剖学联系,并在此基础上提出了著名的“倒置胎儿图”[2],较多的学者对耳疗作用机制进行了研究。近年来,有关耳针机制的研究报道零星可见,然而截至目前耳疗(特别是耳甲区穴位刺激)的机制尚不明了,缺乏系统的理论阐释[3,4],耳穴的信息传入中枢机制尚有待探讨。笔者新近电生理实验观察到耳甲区穴位电针能够激活延髓孤束核处葡萄糖敏感神经元(抑制反应型为主)和胰岛素敏感神经元(激活反应型为主)[5],据此,我们初步认为耳穴作用机制可能与“耳-迷走反射”有关。本研究采用辣根过氧化物酶(HRP)神经示踪法,探讨耳迷走神经分支在延髓水平的投射情况,为“耳-迷走反射”理论假说提供形态学佐证。

   1  材料与方法

  1.1  实验动物及耳甲区HRP微量注射200~250 g的健康成年SD大鼠10只,雌雄不拘, 中国 医学科学院实验动物中心提供,清洁级,合格证编号:A06-53。动物在12 h光照/12 h黑暗的条件下单笼喂养一周,并给予自由饮水及进食。
    
  经2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg)后,在大鼠耳甲部用手术刀片横向划开一条长约2 mm缝口,向外耳道口方向分离缝内耳甲皮肤与皮下组织,微量注射器针头向分离后的缝内注射40 μl HRP(30%,RZ=3.2,Sigma),注射完毕,退针后,紧按缝口3~5 min,每只大鼠两耳各注射3~5个点,注射点尽量分布于整个耳甲艇和耳甲腔。实验过程中严格遵守美国国立卫生院实验动物福利法规定。

  1.2 HRP 组化及四甲基联苯胺(TMB)法显色HRP注射后动物存活36~48 h,经2%戊巴比妥钠腹腔注射深度麻醉(30 mg/kg)后,于升主动脉依次注射冷生理盐水(4℃) 350 ml,1.25%戊二醛和1%多聚甲醛的磷酸缓冲液(pH=7.4)500 ml。灌流固定后,取延髓(闩上下2~3 cm)部位置于30%的蔗糖磷酸缓冲液中,4℃冰箱保存过夜,脱水至组织沉底。次日冰冻切片,片厚30μm,裱于挂胶载玻片上风干以待四甲基联苯胺(TMB) 进行呈色反应。
    
  孵育液配置方法:溶液甲:硝普钠 180 mg,双蒸水 185 ml,醋酸缓冲液 10 ml ( pH 5.0~5.4 );溶液乙:TMB 10 mg,无水乙醇 5 ml。临用前将甲、乙溶液混合。切片以双蒸水洗涤3次后,放入TMB孵育液中,避光孵育20 min后, 每100 ml孵育液中加入0.3%过氧化氢2 ml,避光再反应20 min,不时轻轻晃动,直到出现絮状反应,立即结束反应,以洗保液(95 ml蒸馏水加5 ml醋酸钠缓冲液,pH=3.3)洗片 3 次后,经乙醇梯度脱水后,二甲苯透明,树脂封片,LEiCA显微镜成像系统(DM IRB+Q500IM)下观察阳性标记的细胞情况,并摄像。

   2 结果
    
  除了在三叉神经脊束核(见图1)发现了标记细胞外,在孤束核和迷走神经运动背核也发现了标记神经元或神经纤维,但孤束核与迷走神经运动背核处标记的细胞数没有三叉脊束核标记多。其中孤束核处标记细胞多呈圆形,其胞浆充满了蓝黑色的颗粒,围绕细胞核的周围,其直径约20 μm;迷走神经运动背核处标记细胞多为菱形,细胞大小较迷走神经运动背核处标记细胞大,神经元突触标记明显,并且可见阳性纤维存在,标记神经元直径大约30~40 μm(见图2)。此外在疑核(图3)以及腹外侧网状核(图4)等处也发现了阳性标记细胞,细胞呈圆形或菱形,直径大小约20~30 μm。各核团标记细胞情况见表1。表1  耳甲区注射HRP延脑水平不同核团标记细胞情况(略)

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